UJI STERILITAS, PIROGEN, DAN UJI PIROGEN

Brebes, Jawa Tengah

MAKALAH TEKNOLOGI SEDIAAN FARMASI STERIL

UJI STERILITAS, PIROGEN, DAN UJI PIROGEN

Disusun Oleh:

1.        Dwi Purwanti

2.        Firman Sidiq Putrawan

3.        Himatul Azizah

4.        Jihan Eva

5.        Sinta Dwi Prisilia

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

STIKes BHAKTI MANDALA HUSADA SLAWI

Jl.Cut Nyak Dhien No. 16, Desa Kalisapu, Kec. Slawi, Kabupaten Tegal, Jawa Tengah 52416 Telp.(0283) 6197571

Fax. (0283) 6198450 Homepage website www.stikesbhamada.ac.id email stikes_bhamada@yahoo.com

2017

BAB I

PENDAHULUAN

1.1    Latar Belakang

Sediaan steril memiliki beberapa kriteria, seperti bebas dari mikroorganisme, bebas dari pirogen, bebas dari partikulat dan standar yang sangat tinggi dalam hal kemurnian dan kualitas, bagaimanapun tujuan utama pembuatan sediaan steril adalah mutlak tidak adanya kontaminasi mikroba. Tidak seperti syarat banyak sediaan yang lain, syarat sterilitas adalah nilai yang mutlak. Sebuah sediaan baik steril maupun non steril.

Secara historis, pertimbangan sterilitas bersandar pada uji sterilitas lengkap yang resmi, namun sediaan akhir pengujian sterilitas mengalami banyak batasan. Batasan yang paling nyata adalah sifat dasar dari uji sterilitas. Ini adalah uji yang dekstruktif, sehingga hal ini tergantung pemilihan statistik sampel acak dari keseluruhan.

Jika perkembangan mikroba terdeteksi dalam uji sterilitas, maka hal ini dapat mencerminkan pembacaan positif yang salah (false-positive reading) karena masalah kontaminasi aksidental dari media kultur pada saat uji sterilitas berlangsung. Masalah kontaminasi aksidental adalah hal serius, merupakan batasan yang masih tidak dapat dihindari dari uji sterilitas.

Food and Drug Administration (FDA) menerbitkan pedoman mengenai prinsip umum dari proses validasi. Konsep umum dan elemen kunci dari proses validasi yang betul-betul dapat diterima oleh FDA telah diuraikan. Titik utama yang ditekankan pada pedoman adalah ketidakcukupan kepercayaan dari uji sterilitas sediaan akhir dalam memastikan sterilitas dari kumpulan sediaan parenteral steril. Arti yang lebih besar harus ditempatkan pada validasi proses semua sistem yang terlibat dalam produksi hasil akhir.

1.2    Rumusan Masalah

Rumusan masalah dari latar belakang tersebut adalah sebagai berikut:

1.    Apa yang dimaksud dengan steril, sterilitas dan sterilisasi ?

2.    Apa manfaat dari uji sterilitas ?

3.    Bagaimana metode uji sterilitas ?

4.    Apa yang dimaksud dengan pirogen?

5.    Apa saja sumber-sumber pirogen ?

6.    Bagaimana cara-cara pencegahan pirogen ?

7.    Bagaimana cara menghilangkan pirogen

8.    Sebutkan metode uji aktivitas terhadap pirogen ?

1.3    Tujuan

Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah sebagai berikut:

1.    Untuk mengetahui pengertian sediaan steril, sterilitas dan sterilisasi.

2.    Untuk mengetahui manfaat dan metode uji sterilitas.

3.    Untuk mengetahui apa itu pirogen dan sumber-sumber kontaminan pirogen.

4.    Untuk mengetahui cara-cara pencegahan dan penghilangan pirogen.

5.    Untuk mengetahui metode uji aktivitas terhadap pirogen.

1.4    Manfaat

Semoga makalah ini dapat bermanfaat khusunya bagi penyusun dan umumnya bagi pembaca tentang uji sterilitas, pirogen dan uji pirogen, sehingga dapat menambah pengetahuan mengenai materi tersebut.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1    Definisi Steril, Sterilitas dan Sterilisasi

1.    Definisi steril

a.    Menurut Ansel

Steril adalah bebas dari pencemaran mikroorganisme.

b.    Menurut Sterile Dosage

Steril adalah suatu kondisi absolute dan harus tidak pernah digunakan atau dianggap secara relatif sebagai bahan atau hampir steril.

c.    Menurut RPS

Steril adalah suatu keadaan dimana tidak terdapat lagi mikroorganisme.

d.   Menurut Lachman

Steril adalah kondisi yang memungkinkan terciptanya kebebasan penuh dari mikroorganisme dengan keterbatasan.

2.    Definisi sterilitas

a.    Menurut RPS

Sterilitas adalah karakteristik yang disyaratkan untuk sediaan farmasetik bebas dari mikroorganisme hidup karena metode, wadah atau rute pemakaian.

b.    Menurut Sterile Dosage

Sterilitas adalah karakteristik yang disyaratkan untuk sediaan-sediaan farmasetik karena metode, wadah atau rute pemakaian.

c.    Menurut Pharmaceutical  Dosage

Sterilitas didefinisikan sebagai ketidakhadiran dari semua bentuk organisme.

3.    Definisi sterilisasi

a.    Menurut Scoville’s

Sterilisasi adalah suatu proses membunuh atau menghilangkan bakteri dan mikroorganisme lain.

b.    Menurut Ansel

Sterilisasi adalah suatu proses yang dilakukan terhadap sediaan farmasetik berarti penghancuran sempurna seluruh mikroorganisme dan sporanya atau penghilangan mikroorganisme dari sediaan.

c.    Menurut Mikrobiologi Farmasi Dasar

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh atau memusnahkan semua mikroorganisme atau jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan didalam suatu medium tidak ada lagi mikroorganisme atau jasad renik yang dapat berkembang biak.

2.2    Manfaat Uji Sterilitas

Salah satu tujuan uji sterilisasi pembuatan sediaan steril adalah untuk meminimalkan ketidakpercayaan terhadap pengujian produk akhir. Tiga prinsip yang terlibat dalam proses uji sterilisasi sediaan steril adalah :

1.    Untuk membuat sterilitas kedalam sediaan.

2.    Untuk menunjukkan tingkat kemungkinan maksimum yang pasti dimana proses dan metode sterilisasi memiliki sterilisasi yang terpercaya terhadap semua unit dari batch sediaan.

3.    Untuk memberikan jaminan yang lebih luas dan mendukung hasil dari uji sterilitas sediaan akhir.

Uji sterilitas bermanfaat untuk mengetahui validitas proses sterilisasi dan melakukan kontrol kualitas sediaan steril. Uji ini harus direncanakan dengan baik untuk menghindari hasil positif palsu. Positif palsu dapat terjadi karena kontaminasi lingkungan maupun kesalahan yang dilakukan oleh personil. Lingkungan harus didesain sesuai dengan persyaratan ruang steril yang telah ditetapkan oleh Farmakope terutama mengenai jumlah mikroorganisme maupun jumlah partikel yang hidup di udara. Media yang digunakan untuk uji sterilitas hendaknya dipersiapkan dengan baik dan telah teruji kemampuannya di dalam menumbuhkan mikroorganisme yang dapat berupa jamur maupun bakteri.

2.3    Metode Pengujian Sterilitas

Metode pengujian sterilitas adalah sebagai berikut:

1.    Direct inoculation of culture medium

Meliputi pengujian langsung dari sampel dalam media pertumbuhan.  Prinsip inokulasi langsung adalah mencampurkan sampel langsung dengan media untuk melihat ada atau tidaknya mikroorganisme  yang ditandai adanya kelarutan dalam media.

Prosedur uji inokulasi langsung ke dalam media uji:

Uji pada cairan, pindahkan cairan dari wadah uji menggunakan pipet atau jarum suntik steril. Secara aseptik inokulasikan sejumlah tertentu bahan dari tiap wadah uji ke dalam tabung media. Campur cairan dengan media tanpa aerasi berlebihan. Inkubasi dalam media sesuai dengan prosedur umum selama tidak kurang 14 hari. Amati pertumbuhan pada media secara visual sesering mungkin sekurangnya pada hari ke-3 atau ke-4 atau ke-5, pada hari ke-7 atau ke-8 dan pada hari terakhir masa uji. Jika zat uji menyebabkan media menjadi keruh sehingga ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba tidak segera dapat ditentukan secara visual, pindahkan sejumlah memadai media ke dalam tabung baru berisi media yang sama, sekurangnya 1 kali antara hari ke-3 dan ke-7 sejak pengujian dimulai. Lanjutkan inkubasi media awal dan media baru selama total waktu tidak kurang dari 14 hari sejak inokulasi awal.

2.    Membran filtrasi

Teknik yang banyak direkomendasikan Farmakope, meliputi filtrasi cairan melalui membran steril. Filter lalu ditanam dalam media. Masa inkubasi 7-14 hari karena mungkin organisme perlu adaptasi dulu.

Prosedur uji menggunakan penyaringan membran:

Jika teknik penyaringan membran digunakan untuk bahan cair yang dapat diuji dengan cara inokulasi langsung ke dalam media uji, uji tidak kurang dari volume dan jumlah seperti yang tertera pada pemilihan spesimen uji dan masa inkubasi. Peralatan unit penyaring membran yang sesuai terdiri dari satu perangkat yang dapat memudahkan penanganan bahan uji secara aseptik dan membran yang telah diproses dapat dipindahkan secara aseptik untuk inokulasi ke dalam media yang sesuai atau satu perangkat yang dapat ditambahkan media steril ke dalam penyaringnya dan membran diinkubasi in situ. Membran yang sesuai umumnya mempunyai porositas 0,45mm dengan diameter lebih kurang 47mm, dan kecepatan penyaringan air 55 mL sampai 75 mL per menit pada tekanan 70cmHg. Unit keseluruhan dapat dirakit dan disterilkan bersama dengan membran sebelum digunakan atau membran dapat disterilkan terpisah dengan cara apa saja yang dapat mempertahankan karakteristik penyaring dan menjamin sterilitas penyaring dan perangkatnya. Jika bahan uji berupa minyak, membran dapat disterilkan terpisah dan setelah melalui pengeringan unit dirakit secara aseptic (Anonim, 1995).

2.4    Definisi pirogen

Pirogen berasal dari kata pyro yang artinya keadaan yang berhubungan dengan panas, dan kata gen yang artinya membentuk atau menghasilkan .Pirogen adalah suatu produk mikroorganisme, terutama dari bakteri gram negatif.

Pirogen adalah senyawa dengan berat molekul tinggi yang dinyatakan sebagai senyawa lipopolisakarida yang diproduksi oleh kira-kira 5-10% massa total bakteri. Pirogen ini merupakan senyawa yang jika masuk ke aliran darah akan mempengaruhi suhu tubuh dan biasanya menghasilkan demam. Pengobatan demam yang disebabkan oleh pirogen sangat sulit dan pada beberapa kasus dapat menyebabkan kematian. Pirogen berasal dari kelompok senyawa yang luas, meliputi endotoksin (LPS). Endotoksin adalah suatu molekul yang berasal dari membran luar bakteri gram negatif. Organisme gram negatif membawa 3-4 juta LPS pada permukaannya yang meliputi 75% permukaan membran luar (Sudjadi, 2008).

Pirogen merupakan substansi yang mampu menyebabkan demam terutama dari bakteri gram negatif yang terdiri atas suatu senyawa kompleks lipopilisakarida. Pada saat ini endotoksin diketahui merupakan pirogen yang paling kuat, namun kehadiran pirogen lain dalam suatu sediaan perlu diperhitungkan, karena manusia tidak hanya respon terhadap endotoksin tetapi juga pirogen yang lain (Suwandi, 1988)

Sifat-sifat pirogen:

1.    Termostabil, sehingga hanya dapat dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 650 derajat C selama 1 menit.

2.    Larut dalam air.

3.    Tidak dipengaruhi oleh bakterisida biasa.

4.    Tidak menguap.

5.    Berat Molekul (BM) antara 15.000-4.000000.

6.    Ukuran umumnya 1-50 millimikron.

Pirogen secara garis besar dikelompokkan menjadi dua macam, yaitu:

1.    Pirogen endogen

Pirogen endogen adalah faktor-faktor yang berasal dari dalam tubuh kita sendiri sebagai reaksi kekebalan melawan kuman penyakit yang masuk ke tubuh. Misalnya interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), alpha-interferon, dan tumor necrosis factor (TNF).

2.    Pirogen eksogen 

Pirogen eksogen merupakan faktor eksternal tubuh yang menyebabkan gangguan pada fungsi tubuh manusia. Misalnya bagian dari sel bakteri dan virus. Selain itu, bisa juga berupa zat racun (toksin) yang dihasilkan oleh bakteri atau virus tertentu. 

2.5    Sumber-Sumber Pirogen

Sumber-sumber pirogen adalah sebagai berikut:

1.    Scoville’s: 196

Pada prinsipnya sumber pirogen adalah air destilat yang terlalu terkontaminasi oleh bakteri yang tahan udara yang tumbuh dan menghasilkan endotoksin. Sebagai tambahan, pirogen dapat dibawa ke destilat pada proses destilasi. Sumber lain dari pirogen adalah air yang melekat pada permukaan dalam wadah atau botol labu, yang dipakai dalam penyiapan larutan. Zat terlarut seperti dekstrosa dan NaCl juga dapat dapat mengandung pirogen.

2.    RPS 18^th: 1550

Pirogen dapat masuk kedalam sediaan melalui beberapa cara berupa mikroorganisme hidup atau mati. Mungkin sumber potensial terbesar dari berbagai kontaminasi adalah air yang digunakan dalam proses pembuatan. Walaupun destilasi yang tepat akan menyediakan air bebas pirogen, kondisi penyimpanan harus tidak dapat dimasuki oleh mikroorganisme dan pertumbuhannya dicegah. Sumber potensial yang lain dari kontaminasi adalah perlengkapan. Bahan-bahan pirogen melekat kuat pada gelas dan permukaan lain. Residu larutan dalam peralatan yang digunakan sering menjadi media kultur bakteri dengan kontaminasi pirogenik. Walaupun peralatan yang sudah dicuci dibiarkan basah dan dibiarkan diudara dapat mengandung nutrisi yang nyata untuk pertumbuhan mikroorganisme karena pengeringan tidak menghancurkan pirogen, pirogen dapat tinggal dalam peralatan dalam jangka panjang. Pencucian akan mengurangi kontaminasi dan pemanasan kering akan mencegah kontaminasi peralatan yang cocok untuk digunakan. Bahan terlarut dapat menjadi sumber pirogen. Bahan terlarut dapat mengkristal atau mengendap dari larutan berair yang mengandung kontaminasi pirogenik. Pada proses ini, pirogen dapat dihalangi melalui lapisan partikel. Dalam beberapa kasus, bahan terlarut dapat dimurnikan dengan rekristalisasi dan pencucian pengendapan atau cara lain untuk penghilangan pirogen.

3.    SDF: 46

Kebanyakan sumber utama dari pirogen adalah air yang digunakan untuk membuat larutan. Walaupun air itu sendiri medium kultur yang buruk, kontaminasi dapat terjadi melalui mikroorganisme yang membuat udara dan debu. Seperti yang telah didiskusikan, inilah alasan satu-satunya digunakan dalam sediaan adalah air untuk injeksi. Jika destilasi digunakan untuk menyiapkan air untuk injeksi, masih perlu dirancang dan digunakan dengan lebih baik. Pirogen dipindahkan dari air dengan destilasi, pirogen tidak menguap. Destilasi bebas pirogen dikumpulkan dalam wadah steril dan bebas pirogen. Jika wadah tidak bebas pirogen, pirogen dalam wadah akan dilarutkan dalam air, hal ini yang menyebabkan pirogenik. Jika wadah tidak steril, mikroorganisme dapat tumbuh dan memproduksi pirogen, menghasilkan larutan pirogenik. Tapi ketika dikumpulkan dalam wadah bebas pirogen dan steril, harus digunakan kurang dari 24 jam untuk sediaan produk parenteral yang disterilkan pada perode ini. Jika air untuk injeksi disimpan untuk waktu yang lebih panjang, air untuk injeksi dapat disimpan dalam wadah bebas pirogen dan steril pada suhu 5^o atau 30^o, suhu dimana mikroorganisme tidak akan tumbuh, kemungkinan menghilangkan pirogen. Pilihan lain adalah sterilisasi air untuk injeksi, dengan demikian mempertahankan stabilitas sampai waktu penggunaaan.

2.6    Pencegahan Terhadap Pirogen

Dalam pembuatan sediaan, perlu dilakukan pencegahan agar tidak terdapat pirogen yang terkandung utamanya pada sediaan steril. Berikut adalah cara pencegahan pirogen :

1.    Scoville’s: 196-197

Ada beberapa langkah yang dapat diambil untuk mencegah pemasukan dan peningkatan pirogen dalam cairan parenteral. Hal paling penting adalah dengan tepat merancang dan pengoperasian penyulingan, dicocokkan untuk mencegah tetesan dari air mendidih kedalam destilat. Destilat harus dikumpulkan dalam wadah yang telah dibilas dengan air destilat segar. Perlakuan untuk menghilagkan tetesan-tetesan air yang terakumulasi yang dapat mengandung pirogen atau untuk menghilangkan bahan pirogenik yang dapat mengering dan melekat pada bagian dalam permukaan wadah. Usaha perlindungan menghindarkan kontaminasi destilat oleh bakteri tahan udara harus dilatih. Air destilasi harus terlindung selama penggumpalan dan harus digunakan sesegera mungkin setelah didestilasi untuk mencegah perkembangbiakan bakteri yang mungkin ada. Larutan seharusnya disaring, dikemas, disegel, dan disterilkan dengan secepat mungkin.

2.    Scoville’s: 194

Jauh lebih baik mencegah pembentukan pirogen daripada mengusahakan pemindahan atau penghancurannya. Namun, pirogen dapat dihilangkan dengan adsorbsi pada penyaring asbestos aktif atau pada arang aktif. Kedua metode ini digunakan, khususnya bila diperkirakan bahwa bahan kimia terkontaminasi dengan pirogen. Metode penyaring asbes aktif terdiri dari sediaan larutan yang dilewatkan melalui penyaring asbes kompresi dari serum seitz no 3 pirogen diabsorbsi pada permukaan dari asbes dan oleh karena itu pirogen dihilangkan dari larutan. Juga telah disebutkan bahwa pirogen dapat dihilangkan dengan filtrasi melewati alat penyaring yang lain. Arang aktif juga menghilangkan pirogen dari larutan dengan absorbsi. Larutan dikocok dengan 0,1 % arang aktif serbuk halus selama 5-10 menit. Arang dibiarkan mengendap dan cairan supernatan didekantasiatau arang dapat dihilangkan dengan penyaringan kertas saring yang keras karena serbuk halus arang sulit dihilangkan dengan kertas saring. Hudson menyarankan sistem penyaringan menggunakan kombinasi pasir murni, kertas saring dan penyaring gelas sinter. Arang yang tergranulasi tidak efektif menghilangkan pirogen.

2.7    Cara menghilangkan pirogen

Cara menghilangkan pirogen adalah sebagai berikut:

1.    PTM: 139

Pirogen dapat dipindahkan dari suatu larutan melalui destilasi dan ini merupakan  metode paling tua untuk memperoleh air bebas progen, dasar untuk memperoleh atau memproduksi parenteral volume besar bebas pirogen dalam skala besar. Ultrafiltrasi sampai 100 KD adalah alat yang efektif dari penyaringan endotoksin yang mempunyai BM kira-kira 20 KD tetapi pada kenyataannya ukuran agregat paling kurang 1000 KD. Osmosa balik juga efektif memindahkan partikel samapai 1 nm, meliputi endotoksin. Disisi lain, norit aktif, serat asbes dan polipropilen atau politeffiber atau permukaan, seluruhnya efektif menyerap pirogen, utamanya melalui interaksi hidrofobik. Pirogen atau endotoksin yang diadsorbsi dalam permukaan lebih sulit untuk di pindahkan. Permukaan elestomerik seperti pada segel dan penutup tidak dapat dipanaskan. Pirogen disini disyaratkan untuk dipindahkan melalui pembilasan dengan air pirogenik. Banyak permukaan logam atau gelas dapat diolah secara kimia, kebanyakan bahan pengoksidasi seperti peroxid atau permanganat menjadi efektif. Sterilisasi panas kering tidak efektif, tekanan pada 20 psig disyaratkan selama paling kurang 5 jam untuk menghancurkan kebanyakan endotoksin. Metode depirogenisasi ini di pilih untuk permukaan adalah panas kering pada suhu sekitar 160-250^oC paling kurang 30 menit kondisi yang baik yang telah diset. Pengolah ini mengasumsikan  bahwa peralatan pada bagian permukaan dapat dipanaskan, dan tentu saja sangat sedikit produk yang dapat diolah dengan cara ini. Wadah gelas, setelah pencucian dengan air untuk injeksi, dikeringkan dan dipanaskan di bawah kondisi aliran laminar pada oven berkesinambungan suhu 250^oC atau lebih tinggi. Kondisi ini meliputi kombinasi pengeringan, oksidasi dan pembakaran untuk menghancurkan bahan pirogen.

2.    SDF: 46-47

Pirogen dipindahkan dari air dengan destilasi, pirogen tidak menguap. Destilasi bebas pirogen dikumpulkan dalam wadah steril dan bebas pirogen. Air untuk injeksi, ketika dikumpulkan dalam wadah bebas pirogen dan steril, harus digunakan kurang dari 24 jam untuk sediaan produk parenteral yang disterilkan pada periode ini. Jika air untuk injeksi disimpan untuk waktu lebih panjang, air untuk injeksi dapat disimpan dalam wadah bebas pirogen dan steril pada suhu 5-80^oC suhu dimana mikroorganisme tidak akan tumbuh, kemungkinan menghilangkan pirogen. Pirogen dapat dihilangkan dari wadah logam dan gelas melalui panas kering. Ketika metode tidak praktis untuk ukuran wadah atau bukan metode pilihan untuk alat-alat pada panas kering, pirogen dapat dihilangkan melalui pembilasan wadah dengan baik dengan air untuk injeksi bebas pirogen, pirogen larut air, dipindahkan melalui pembilasan yang diulang.

3.  RPS 18^th: 1850

Pirogen dapat dihancurkan melalui pemanasan pada temperatur tinggi. Prosedur yang direkombinasikan untuk depirogenasi gelas dan peralatan adalah pemanasan pada suhu 250^oC selama 45 menit. Telah dilaporkan bahwa 650^oC selama 1 menit atau selama 4 jam diharapkan dapat menghancurkan pirogen. Hal itu dipastikan bahwa pencucian yang teliti dengan deterjen akan menjadikan wadah gelas bebas pirogen jika dilindungi selama proses produksi dan penyimpanan dari kontaminasi pirogen berat. Putaran autoklaf biasa tidak bisa melakukan hal ini. Pemanasan dengan alkali kuat dan atau larutan oksidasi akan menghancurkan pirogen. Suatu metode yang digunakan untuk memindahkan pirogen dari larutan adalah adsobsi dalam bahan adsortif. Namun, karena fenomena adsorbsi juga dapat menyebabkan pemindahan selektif dari bahan kimia dari larutan dan filtrat dapat dikontaminasi dengan bahan, metode ini dibatasi penggunaannya.

2.8    Metode Uji Aktivitas Pirogen

Uji pirogen dimaksudkan untuk membatasi resiko reaksi demam pada tingkat yang dapat diterima oleh pasien pada pemberian sediaan injeksi. Pengujian meliputi pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah penyuntikan larutan uji secara i.v dan ditujukan untuk sediaan yang perlu penyiapan pendahuluan atau cara pemberiannya perlu kondisi khusus ikuti petunjuk tambahan yang tertera pada masing-masing monografi.

Alat dan pengencer. Alat suntik, jarum dan alat kaca dibebas pirogenkan dengan pemanasan pada suhu 250^oC selama tidak kurang dari 30 menit atau dengan cara lain sesuai dengan perlakuan semua pengencer dan larutan untuk pencuci dan pembilas alat suntik dengan cara sedemikian rupa yang dapat menjamin alat tersebut steril dan bebas pirogen. Lakukan uji pirogen terhadap pengencer dan larutan pencuci dan pembilas secara berkala. Apabila digunakan injeksi NaCl sebagai pengencer, gunakan injeksi yang mengandung larutan NaCl PO 9 %.

1.    Rabbit Test

a.    Rekaman suhu

Gunakan alat pengukur suhu yang teliti seperti termometer klinik atau termistor atau alat sejenis yang telah dikalibrasi untuk menjamin ketelitian skala kurang lebih 0,1 yang telah diuji bahwa pembacaan suhu maximum tercapai <5 menit masukkan alat pengukur suhu kedalam anus kelinci dengan kedalam tidak <7,5  cm dan sesudah jangka waktu tidak kurang dari yang telah ditetapkan sebelumnya, tekan suhu tubuh kelinci.

b.    Hewan uji

Gunakan kelinci dewasa yang sehat. Tempatkan kelinci satu ekor dalam satu kandang dalam ruang dengan suhu yang seragam antara 20-23^oC dan bebas dari gangguan yang menimbulkan kegelisahan. Beda suhu tidak boleh berbeda kurang lebih 3^oC dari suhu yang telah ditetapkan. Untuk kelinci yang belum pernah digunakan untuk uji pirogen, adaptasikan kelinci tidak boleh lebih dari tujuh hari dengan uji pendahuluan yang meliputi semua tahap pengujian yang tertera pada prosedur, kecuali penyuntikan, kelinci tidak boleh digunakan untuk uji pirogen lebih dari sekali dalam waktu 48 jam atau sebelum 2 minggu setelah digunakan untuk uji pirogen bila menunjukkan kenaikan suhu maksimal 0,6^oC atau lebih.

c.    Prosedur

Lakukan pengujian dalam ruang terpisah yang khusus untuk uji pirogen dan dengan kondisi lingkungan yang sama dengan ruang pemeliharaan, bebas dari keributan yang menyebabkan kegelisahan. Kelinci tidak diberi makan selama waktu pengujian. Minum dibolehkan pada tiap saat, tetapi dibatasi pada saat pengujian. Apabila pengujian menggunakan termistor, masukkan kelinci kedalam kotak penyekap sedemikian rupa sehingga kelinci tertahan dengan letak leher yang longgar sehingga dapat duduk dengan bebas. Tidak lebih dari 30 menit sebelum penyuntikan larutan uji, tentukan “suhu awal” masing-masing kelinci yang merupakan dasar untuk menentukan kenaikan suhu. Beda suhu tiap kelinci dalam satu kelompok tidak boleh lebih 1^oC dan suhu awal setiap kelinci tidak boleh lebih dari 39,8^oC. Kecuali dinyatakan lain pada masing-masing monografi, suntikkan 10 ml/kg bb, melalui vena tepi telinga 3 ekor kelinci dan penyuntikan dilakukan waktu 10 menit. Larutan uji berupa sediaan yang bila perlu yang dikonstitusi seperti yang tertera pada masing-masing monografi dan disuntikkan dengan dosis seperti yang tertera. Untuk uji pirogen alat atau perangkat injeksi, gunakan sebagai larutan uji hasil cucian atau bilasan dari permukaan alat yang berhubungan langsung dengan sediaan parenteral, tempat penyuntikan atau jaringan tubuh pasien. Semua larutan harus bebas dari kontaminasi. Hangatkan larutan pada suhu 37^o + 2^o sebelum penyuntikan. Rekam suhu berturut-turut antara jam ke-1 dan jam ke-3 setelah penyuntikan dengan selang waktu.

d.   Penafsiran hasil

Setiap penurunan suhu dengan nol. Sediaan memenuhi syarat apabila tak seekor kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0,5^oC atau lebih. Jika ada kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu 0,5^oC atau lebih. Lanjutkan pengujian dengan menggunakan lima ekor kelinci. Jika tidak lebih dari tiga ekor dari 8 ekor kelinci masing-masing menunjukkan kenaikan suhu 0,5^oC atau lebih dan jumlah kenaikan suhu maksimal 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3,3^oC sediaan dinyatakan memenuhi syarat bebas pirogen

2. LAL (Limulus amebocyte lysate)

Baru-baru ini telah ditemui bahwa ekstrak sel darah ketam sepatu kuda (Limulus polyphemus) mengandung sistem enzim dan protein yang menggumpal bila ada liposakarida dalam jumlah kecil. Penemuan ini, merangsang perkembangan uji Limulus amebocyte lysate (LAL) untuk mengetahui adanya pirogen dalam kerja penelitian dan pengawasan selama proses berlangsung. Usulan-usulan untuk uji produk akhir obat dengan LAL sedang dipertimbangkan oleh FDA (Ansel, 1989).

Uji LAL adalah metode spesifik untuk bakteri endotoksin, hanya untuk pirogen yang signifikan pada kebanyakan pabrik farmasetikal dan peralatan medis. Test didasarkan pada mekanisme primitif penggumpalan darah dari kepiting seperti Kuda Amerika (Limulus polyphemus). Berberapa enzim diletakkan pada sel darah amoeba kepiting yang dipicuh oleh endotoksin perpanjangan koagulasi enzimatik yang di akhiri dengan produksi di gel protenose (Aulton, 1990).

Test harus dihindarkan dari kontaminasi antimikroba sebelum dihindarkan, test ini penting untuk memastikan bahwa tidak ada factor campuran dalam sediaan, peralatan tidak menyerap endotoksin (seperti pada beberapa plastic) dan sensitifitas dari lisat diketahui (Aulton, 1990).

Reagen test LAL disediakan dengan lyopilisasi sel di mubasit limulus. Volume setara reagen LAL dan larutan test (0,1 mikron per masing-masing) dicampurkan dalam gelas tube test elipirogenasi. Tube diinkubasikan pada suhu 37^oC selama 1 jam, setelah test wadah dibaca. Tube diambil dari inkubator dan diubah. Bekuan oleh yang rusak mengandung energi padatan merupakan factor dari test positif. Ketika digunakan pada bagian ini bekuan gel uji awalnya, melewati test kegagalan dibatasi dan reagen sensitive LAL (Aulton, 1990).

Test LAL tambahan test ini dapat digunakan dalam laboratorium farmaseutikal. Test ini spesifik untuk endotoksin gram negatif, dimana test pirogen kelinci sensitif untuk semua pirogen endotoksin dan sumber lain disbanding gram negatif (Aulton, 1990).

BAB III

PENUTUP

3.1    Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat diambil dari makalah ini antara lain adalah sebagai berikut:

1.  Steril adalah suatu keadaan dimana tidak terdapat lagi mikroorganisme. Sterilitas didefinisikan sebagai ketidakhadiran dari semua bentuk organisme. Sedangkan sterilisasi adalah suatu proses membunuh atau menghilangkan bakteri dan mikroorganisme lain.

2.  Uji sterilitas bermanfaat untuk mengetahui validitas proses sterilisasi dan melakukan kontrol kualitas sediaan steril.

3.  Metode pengujian sterilitas, yaitu Direct inoculation of culture medium  dan membran filtrasi.

4.  Pirogen merupakan substansi yang mampu menyebabkan demam terutama dari bakteri gram negatif yang terdiri atas suatu senyawa kompleks lipopilisakarida.

5.  Sumber-sumber pirogen pada prinsipnya sumber pirogen adalah air destilat yang terlalu terkontaminasi oleh bakteri yang tahan udara yang tumbuh dan menghasilkan endotoksin.

6.  Cara pencegahan pirogen yaitu dengan tepat merancang dan pengoperasian penyulingan, dicocokkan untuk mencegah tetesan dari air mendidih kedalam destilat.

7.  Cara menghilangkan pirogen yaitu dengan cara memindahkan dari suatu larutan melalui destilasi.

8.  Metode Uji Aktivitas Pirogen yaitu Rabbit Test dan LAL (Limulus amebocyte lysate).

3.2    Saran

Semoga dengan adanya makalah ini diharapkan pembaca dapat memahami tentang uji sterilitas, pirogen dan uji pirogen, sehingga dapat menambah pengetahuan mengenai materi tersebut. Makalah ini masih jauh dari kata sempurna, oleh karena itu kritik dan saran dari pembaca yang sifatnya membangun sangat kami harapkan.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta: Depkes RI.

Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi.  Jakarta: UI Press.

Aulton, Michael. 1990. Pharmaceutical Practice. London: Oritic Livingston.

Ganong, W.F. 2002. Pengaturan Sentral Fungsi Visera. Dalam : Widjajakusumah M.D., Editor.  Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 20. Jakarta: EGC.

Gennaro, A. R, et al. 1990. Remingons Pharmaceutical Science 18^th Edition. Pensylvania: Marck publishing company.

Lachman, et al. 1986. Teori dan Praktek Industri Farmasi Third Edition. Philadelphia:  Lea and Febiger.

Parrot, L. Eugene. 1971. Pharmaceutical Technology Fundamental Pharmaceutics. Minnepolis: Burgess Publishing Company.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi kesehatan. Yogyakarta: Kanisius.

Suwandi. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyt Lysate. Cermin Dunia Kedokteran  no.52.

Turco, Salvatore dan Robert E. 1974. Sterile Dosage Forms. London  : Published in Great Britain by Henry Kimpton Publishers.

Walter F., PhD. Boron. 2003. Medical Physiology: A Cellular And Molecular Approaoch. Elsevier/Saunders. p. 1300. ISBN 1-4160-2328-3. Jenkins, G.L. Scoville's:The Art of Compounding. USA: Burgess Publishing.